Antifolates是拮抗叶酸（维生素B9）作用的化合物。叶酸在人体内的主要功能是丝氨酸，甲硫氨酸，胸苷和嘌呤生物合成的各种甲基转移酶的辅因子。因此，Antifolates抑制细胞分裂，DNA/RNA合成和修复以及蛋白质合成。例如Proguanil，Pyrimethamine，Trimethoprim选择性地抑制叶酸在微生物如细菌，原生动物和真菌中的作用。大多数Antifolates通过抑制二氢叶酸还原酶（DHFR）起作用。主要是DHFR抑制剂，但Raltitrexed是胸苷酸合成酶的抑制剂，Pemetrexed抑制二者和第三种酶。在DNA和RNA合成期间，Antifolates起特异性作用，细胞周期的S期期间具有细胞毒性。它们对迅速分裂的细胞具有更大的毒性作用。